全 文 ：第 34卷　第 5期 西 南 师 范 大 学 学 报(自然科学版) 2009年 10月Vol.34　N o.5 　　Journal of Southwest China Normal University (Natural Science Edition) Oct. 2009文章编号:1000-5471(2009)05-0111-06蜘蛛兰的一种新病害 ———褐斑病的鉴定记述①谭舒心 , 　谭万忠 , 　王教敏 , 　王利军 , 　周　君西南大学 植物保护学院 , 重庆 400716摘要:从观赏花卉蜘蛛兰(H ymenocallis littoralis)上发现一种叶部病害 , 通过组织分离 、 纯化获得 2 种真菌 , 按照柯赫氏证病律方法确定其均为该病害的病原菌.根据 2 种真菌的菌落 、 分生孢子盘和分生孢子等的形态特征鉴定 , 它们分别为刺盘孢(Colletotrichum sp.)和拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.).病菌主要侵染植株的叶片 , 接种试验表明它们可以单独侵染 , 也可以复合侵染 , 引起相似的症状 , 但 2 种病菌混合接种后发病更快更重.室内接种叶片和田间自然发病叶片上的症状相同 , 初为水渍状灰褐色的小点 , 扩展后形成典型的圆形或椭圆形病斑 , 中央灰色至灰褐色 , 边缘紫褐色至红色 , 周围有明显的黄色晕圈带 , 后期病斑互相连接 , 导致叶片大面积或全部成灼烧状枯死并萎垂.该文描述了 2 种病原菌的菌落 、 分生孢子盘和分生孢子等主要结构的形态特征 , 但它们的种名还需要进一步研究确定.关　键　词:蜘蛛兰褐斑病;刺盘孢菌;拟盘多毛孢;症状及病原菌中图分类号:Q949.71+8.25 文献标识码:A蜘蛛兰(Hymenocall is li t toralis(Jacq.)Salisb.)又名水鬼蕉 , 为石蒜科(Amary llidaceae)水鬼蕉属的多年生球根花卉植物 , 原产于热带美洲 , 主要分布于南美洲和东南亚(如菲律宾 、缅甸 、马来西亚 、巴布新几内亚等)国家的热带丛林地区[ 1-2] .蜘蛛兰是我国二级保护植物 , 具有较高的观赏价值和药用价值 , 在我国广东 、广西 、福建 、云南和重庆等南方省市大面积分布 , 用于庭院和行道等的绿化栽培.2008 年春 、夏季 , 我们对重庆地区的蜘蛛兰病害进行了广泛的田间调查 , 发现了一种新的叶部病害 , 通过采集田间病叶标本回室内进行常规组织分离纯化 , 得到 2种病原真菌 , 根据症状和病原菌将其鉴定命名为蜘蛛兰褐斑病.查阅现有相关资料和文献 , 尚未见目前国内外对蜘蛛兰这种病害的研究报道.本文报道对这种病害及其病原菌的诊断鉴定结果.1　材料和方法1.1　材　料菌种来源:从田间采集具有典型病害症状的蜘蛛兰病叶 , 分离 、纯化获得真菌纯培养 , 于试管斜面培养基上低温(4 ℃冷藏箱)保存.使用前将其转移到 PDA 平板培养基上 , 于 25 ℃恒温培养箱内培养 7 d后用于接种处理.培养基:本研究中分离和培养病原菌均采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基 , 其配方为:葡萄糖20 g 、琼脂粉 20 g 、马铃薯 200 g 和蒸馏水 1 000 mL[ 3] .①收稿日期:2008-12-11作者简介:谭舒心(1982-), 女 , 吉林长春人 , 硕士研究生 , 主要从事植物病害及有益微生物研究.通讯作者:谭万忠 , 教授.1.2　方　法1.2.1　从病害标本中分离纯化病原物分别选取带有典型病斑的叶片 , 样本表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3 mm×3 mm 大小的组织块[ 3] , 于无菌超净工作台上依次在 70%的酒精中浸洗 3 ～ 5 s , 0.1%的升汞中消毒30 ～ 45 s , 然后在灭菌水中连续漂洗 3次去除残余的升汞 , 取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分 , 置于事先备好的 PDA平板上 , 于 25 ℃恒温培养箱中培养.36 ～ 72 h 后形成菌落 , 切取典型菌落边缘的菌丝块 , 移植到新的 PDA平板培养基上培养获得分离物的纯培养 , 转入试管 , 于 4 ℃冷藏箱中保存备用.1.2.2　分离物致病性测定1)蜘蛛兰的培植:将含有大量腐殖质的肥沃土壤灭菌 , 并将充分腐熟的有机肥施于土中 , 然后装入预先消毒的直径为 20 cm 的花盆中备用.将精选健康的并且大小适中的蜘蛛兰球根植于花盆中 , 覆土 1.5 cm左右 , 浇水后培育在 25 ℃的温室中备用[ 4-5] .2)接种病原菌的准备:将分离所得的 2种真菌在 PDA培养基平板上培养 7 ～ 10 d , 加入无菌水洗脱 ,用消毒沙布过滤 , 分别制成 2.5×107 个/mL 浓度的孢子悬浮液备用.3)单菌接种试验:采用离体叶片和盆栽植株叶片针刺悬滴法接种[ 3] .在离体叶片试验中 , 从温室盆栽健康植株上选取完全展开的叶片 , 用无菌水冲洗干净并晾干后剪成约 14 cm 长的叶段 , 平放于白瓷盘中 ,用大头钉轻轻刺伤部分叶面 , 将 2.5×107 个/mL 浓度的分生孢子悬浮液用无菌的胶头滴管滴于针刺处.在蜘蛛叶片试验中则是直接将叶面刺伤后点滴接种 , 对照叶段或植株叶片刺伤后用清水点滴.每个处理 10个重复(叶段或叶片), 接种处理后用塑料膜密封保持高湿度 , 放入 25 ℃生长培养箱中培养 , 定期喷水 , 每天观察记录侵染及病害发展情况.4)病原菌复合接种:采用离体叶段针刺悬滴法接种[ 3] .将 2个菌株的孢子悬浮液按 1∶1的比例混合后 , 再按上述离体叶片试验方法接种 , 每个处理重复 10个叶段 , 接种后在 25 ℃生长培养箱中培养 , 并于接种后每天观察记录病害发生发展情况.待接种植株的叶片出现症状后 , 用组织分离法[ 6] 对病原菌进行再分离 , 分别移于 PDA 培养基中央25 ℃, 12 h/d光照培养 7 d后 , 对前后分离病原菌的培养性状 、分生孢子以及分生孢子梗等形态特征 , 结合组织切片和病原的形态等进行比较.1.2.3　病原菌的形态学观察与鉴定在 PDA 平板上培养病原菌 , 适时观察记录病原菌的主要形态特征.菌落直接用数码相机拍摄 , 真菌的菌丝和分生孢子制片后在光学显微镜下观察 , 并用显微成像系统拍摄.最后根据真菌菌落 、分生孢子盘及分生孢子等的形态特征 , 参考有关真菌的参考文献[ 7-8]对病原菌做出鉴定.1.2.4　症状观察在田间和温室内观察病害症状 , 按照一般植物病害症状的观察方法和记述要点 , 直接记载病害发展过程中的病状和病征 , 并直接拍摄记录病斑特征.2　结果与分析2.1　病害症状与侵染性用分离纯化后的病原菌悬浮液针刺接种蜘蛛兰叶片 , 接种后 2 d 即可见明显水渍状小病斑 , 并于 7 d后出现典型病斑 , 接种 25 d后部分叶片枯死.同时 , 接种后叶片的发病率达 100%, 可导致整个植株大面积褐变 , 甚至整个叶片坏死萎蔫.采用 2种病菌分别接种和混合接种后的症状略有差异.1)刺盘孢接种侵染:用刺盘孢分生孢子液接种的蜘蛛兰发病初期叶片出现 3 ～ 8 mm 大小不等的赭红色或红褐色病斑 , 保湿培养 7 d后一些病斑中央产生橘红色油球状分生孢子堆 , 病斑边缘有淡黄色不整齐晕圈.随后整个叶片陆续出现病斑 , 典型病斑中部有凹陷 , 出现较早的病斑继续扩大连成一片 , 使叶片大112 西南师范大学学报(自然科学版)　　　　　投稿网址 ht tp://xbgjx t.sw u.cn　　　　第 34卷面积枯萎(图 1).图 1　刺盘孢接种第 8天(左)和第 18天(右)的病害症状2)拟盘多毛孢接种侵染:用拟盘多毛孢分生孢子液接种的蜘蛛兰发病初期叶片出现黄色小斑点 , 逐渐扩大为典型卵圆形或梭形叶斑 , 病斑外缘有淡黄色晕圈 , 中部呈褐色.随着接种后培养时间的延长 , 病斑进一步扩大成梭形褐色大斑 , 并相连成片 , 致使较大叶面变褐枯死(图 2).与刺盘孢比较 , 拟盘多毛孢接种后的症状较严重 , 因此其侵染性相对较强.图 2　拟盘多毛孢接种第 8天(左)和第 18天(右)的病害症状3)2种病原菌复合接种侵染:将具有致病力的 2种菌孢子悬浮液均匀混合 , 接种到蜘蛛兰叶片上 , 其发病症状与 2种菌单独接种相似 , 但复合接种发病率超过单独接菌 , 潜伏期也明显缩短 , 接种后 2 d即可显症 , 出现水浸状小斑点 , 4 d即形成 4 ～ 10 mm 大小不等的圆形 、椭圆形或梭形 、赤红色或红褐色 , 病斑周围有黄绿色的晕圈.以后病斑较快速地扩大相连 , 中央处组织枯萎坏死(图 3), 18 d 后症状比单独接种的发病显著严重得多.2种菌室内混合接种产生的症状与自然田间植株叶片上的症状基本相同.图 3　2种病原菌复合接种第 6天(左)和第 18天(右)的病害症状2.2　病原菌的主要形态学特征由病样组织分离和接种试验证明 , 导致蜘蛛兰褐斑病的病原菌有 2种 , 经鉴定为刺盘孢(Colletotri-chum sp.)和拟盘多毛孢(Pestalot iopsis sp.), 它们的主要形态特征如下(图 4).113第 5期　　　　　　　　　谭舒心 , 等:蜘蛛兰的一种新病害———褐斑病的鉴定记述1)刺盘孢:在 PDA 培养基上于 25 ℃培养 5 d后 , 菌落直径达 70 mm , 菌落(图4A)圆形 , 气生菌丝较发达 , 白色 , 绒毛状 , 后变浅灰色 , 边缘较整齐.菌丝(图 4C)无色 , 分隔非常明显 , 直径约 1.2 ～ 2.4μm.7～ 8 d后 , 菌落中心表面长出橘红色 、具光泽且湿润的分生孢子堆 , 生于气生菌丝层下 , 这使得整个菌落呈红色.分生孢子(图 4B)长椭圆形或短圆柱形 , 无色 , 单孢.分生孢子内有 1 ～ 2个油球 , 大小为(16.0 ～ 24.5)×(4.8 ～ 6.0)μm.对病叶组织进行切片可见分生孢子盘生于寄主植物表皮下(图 4D), 分散或合生 , 成熟后不规则形开裂 , 浅盘状 , 生有刚毛 , 刚毛直立 , 褐色至暗褐色 , 具分隔 , 表面光滑 , 至顶端渐尖.分生孢子梗较短 , 呈栅状排列于分生孢子盘底部 , 无色至褐色 , 具分隔 , 基部分枝 , 光滑.A:PDA 上第 5天菌落;B:分生孢子;C.菌丝;D:分生孢子盘及刚毛图 4　蜘蛛兰刺盘孢的形态2)拟盘多毛孢:在 PDA 培养基上 , 25 ℃培养5 d后菌落(图5A)直径可达 65 mm 以上 , 光照与黑暗对病菌生长产孢没有明显的影响.病菌菌落圆形 , 表面气生菌丝较发达 , 白色 , 短絮状 , 呈辐射状扩展 , 后期颜色变灰暗.菌丝(图 5C)无色 , 分隔 , 直径约 1.5 ～ 3.0 μm.4 ～ 5 d后菌落表面长出黑色油圆球状或不规则状 、具光泽而湿润的分生孢子堆 , 呈放射状分布.随培养时间延长 , 分子孢子堆大量产生 , 有的在菌落表面联合成片.分生孢子(图 5B)纺锤形或倒棍棒状 , 大小为(15.6 ～ 27.5)×(4.5 ～ 7.6)μm , 直或稍微弯曲 , 5个细胞 , 各细胞之间分隔均为真隔膜 , 两端细胞壁薄 , 无色 , 中间 3个细胞呈橄榄褐色 , 色泽一致.顶部细胞无色 , 圆锥形 , 较中部细胞直径明显变小 , 顶端附属丝 2 ～ 3条 , 基部细胞无色倒圆锥形 , 附属丝 2 ～ 3根 , 中生式尾毛 1根 , 约为附属丝长度的 1/4.对病组织进行切片可见分生孢子盘杯状(图 5D), 散生或集生 , 初埋生后外露 , 黑色或暗褐色底层由厚壁 、角状 、暗褐色细胞构成 , 盘表面产孢区细胞壁薄 , 色淡.分生孢子梗较短 , 着生于分生孢子盘基部 , 无色或浅褐色 , 分隔 , 不规则分枝.3　结论与讨论用柯赫氏证病律的方法证明了一种刺盘孢(Colletotrichum sp.)和一种拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)是引起所述蜘蛛兰叶部病害的病原菌 , 根据病害症状及病原菌将这种病害命名为蜘蛛兰褐斑病.室内接种114 西南师范大学学报(自然科学版)　　　　　投稿网址 ht tp://xbgjx t.sw u.cn　　　　第 34卷试验表明 , 2种病菌既可单独侵染 , 也可复合侵染致病.复合侵染显症更快 , 病斑扩展更迅速 , 由此推测田间自然条件下 2种病菌均可能单独侵染或复合侵染引起蜘蛛兰褐斑病的发生.A:PDA 上第 5天菌落;B:分生孢子;C:菌丝;D:分生孢子盘及刚毛图 5　蜘蛛兰拟盘多毛孢的形态本文参照陆家云等[ 7] 的《病原真菌学》及魏景超[ 8] 的《真菌鉴定手册》记述 , 从菌落 、分生孢子盘和分生孢子等的观察对这 2种病原菌的主要形态特征分别作了较详细的描述 , 将其鉴定到属.但是 , 由于各方面的条件限制及我们对刺盘孢属和拟盘多毛孢属分类知识 、参考文献的匮乏 , 目前尚未将它们鉴定到种.我们已经将其样品寄送到相应的权威真菌实验室或专家作进一步的形态分析和分子检测鉴定 , 以最终确定它们的种级分类阶元名称.另外 , 刺盘孢属和拟盘多毛孢属真菌均属于半知菌亚门的腔菌纲 , 有性时期分别为子囊菌亚门核菌纲球壳目的小丛壳属(Glomerel la Schrenk et Spauld.)和盘多毛球壳属(PestalosphaeriaBarr)[ 9] , 但我们在室内和田间作了大量观察都未看到它们的有性时期.对此 , 今后还需要继续探讨.据我们的调查表明 , 蜘蛛兰褐斑病在重庆不同地区广泛发生 , 在云南 、贵州和四川等地发生也较普遍.在有的地方危害非常严重 , 阻碍植株的正常生长发育 , 甚至地上部植株大量死亡 , 从而影响绿化景观 , 需要采取相应的防治措施以控制危害.本研究仅对这种新病害进行了诊断鉴定和初步的观察 , 随后还将对病原菌的生物学 、侵染机理和分类学特性 、病害的流行学规律及控制等作系统作深入的研究[ 10-14] , 并由此提出安全 、经济 、有效的病害综合控制策略和技术措施.参考文献:[ 1] 张宏志 , 唐前瑞 , 龙岳林 , 等.蜘蛛兰的组织培养 [ J] .湖南林业科技 , 2005 , 32(3):22-23.[ 2] 　Shi S D , Qiu Y X , Li E 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disease w ere characterized the init ial smal l circula r purple spots on leaves ,which developed to oval spots and may join toge ther to form large ir regular spo ts.The spots are brow n atthe center , deep purple at the bo rder and surrounded by a yellow halo o f new ly-infected t issue.Iso lationand inoculation show ed that tw o fungal species w ere the pathogens causing the disease:Colletotrichum sp.and Pestalot iopsis sp.They induced blo tch symptoms on leaves af ter separate and combined inoculations.The disease w as widely dist ributed in Chongqing and o ther provinces of Southwest China and significantdamages w ere f requently observed in some gardens o r spider li ly plantations.The disease symptoms andthe morpho logy of pathogens are described and further wo rks on epidemio logy and control o f the diseaseare discussed in the paper.Key words:brow n leaf blotch of spider lily;Colletotrichum sp;Pestalotiopsis sp;disease symptoms andpathogens责任编辑　夏　娟　　　　116 西南师范大学学报(自然科学版)　　　　　投稿网址 ht tp://xbgjx t.sw u.cn　　　　第 34卷